Pembiakan tahap kedua (F2) bertujuan memperbanyak miselium jamur yang berasal dari biakan murni. Pada dasarnya, langkah-langkah yang dilakukan di pembiakan F2 tidak berbeda dengan pembiakan F1 , meliputi penyiapan bahan, inokulasi, dan inkubasi. Hanya media yang digunakan berbeda. Penyiapan Media Media pembiakan F2 berbeda dengan media pembiakan F1 karena media F2 berhubungan dengan media tanam di kumbung. Bahannya berupa serbuk kayu atau dicampur dengan bahan-bahan lain, seperti dedak dan biji-bijian. Media untuk pembiakan F2 harus memenuhi persyaratan ideal pertumbuhan miselium jamur, yaitu banyak mengandung unsur C (karbon) dalam bentuk karbohidrat. unsur N (nitrogen) dalam bentuk amonium, dan unsur Ca (kalsium) yang berfungsi menetralkan asam oxalat yang dikeluarkan miselium. Oleh karena itu, media dengan bahan campuran serbuk kayu dan biji-bijian dianggap lebih baik karena kandungan unsur-unsur yang dibutuhkan jamur lebih lengkap dibandingkan dengan yang berbahan serbuk kayu saja. Ada dua formula yang sering digunakan sebagai media pembiakan F2 seperti terlihat di tabel Formula Bahan (%) Serbuk Kayu Bekatul/dedak Kalsium Karbonat Kalsium Sulfat Biji-bijian I 80 20 - - - II 40 - 11 5 Diolah dari berbagai sumber Jika menggunakan formula i, serbuk kayu dan bekatui atau dedak dicampur jadi satu dan ditambahkan air sampai kadar airnya menjadi 45-65. Jika menggunakan formula II, biji untuk campuran harus direbus terlebih dahulu selama 15 menit sampai mekar. Perlu diperhatikan, biji yang digunakan haruslah biji yang bernas, yaitu biji yang tidak tenggelam saat direndam di dalam air. Setelah itu, campurkan biji dengan serbuk kayu, kalsium karbonat, dan kalsium sulfat, lalu aduk sampai merata. Kemudian tambahkan air bersih sampai kadar airnya mencapai 45-65. Mengetahui kadar airnya sudah sesuai atau belum bisa dilakukan dengan mengepal erat campuran media. Jika sudah tidak pecah dan tidak meneteskan air, berarti kadar airnya sudah sesuai. Media F2 dimasukkan ke dalam wadah berupa botol atau kantong plastik. Banyaknya sekitar 2/3 bagian wadah tanpa dipadatkan. Kemudian, di permukaan media dilubangi sedalam 3 cm dengan diameter I cm, menggunakan alat berupa kayu berbentuk bulat.. Caranya, tusukkan kayu tersebut tepat di tengah-tengah permukaan media, lalu cabut sambil putar-putar sampai permukaan media berlubang. Setelah itu, wadah ditutup dengan kapas hingga rapat dan dilapisi dengan kertas perkamen atau aluminium foil. Kemudian disterilisasi dalam autoklaf pada suhu 121º C dengan tekanan 1,1 atmosfer selama satu jam. Sebelum diinokulasi, media F2 didinginkan selama sekitar 12 jam. Sumber : Budi Daya Jamur, AgroMedia